La dieta a-proteica

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Attivazione dell’autofagia nei pazienti con miopatia col6 attraverso una dieta pilota sperimentale a-proteica.

Uno studio-pilota basato sulla modulazione nutrizionale è stato progettato per valutare l’efficacia di una dieta a basso contenuto proteico nell’arco di un anno per attivazione dell’autofagia nel muscolo scheletrico dei pazienti affetti da miopatie COL6. La distrofia muscolare congenita di Ullrich e la miopatia di Bethlem sono rare malattie muscolari ereditarie causate da mutazioni dei geni COL6, A1 A2 A3, e per le quali non è ancora disponibile una cura. Studi sui topi carenti di col6 hanno rivelato che la degenerazione della fibra muscolare coinvolge difetti autofagici e che l’attivazione forzata di autofagia determina il miglioramento della patologia muscolare. Sette pazienti adulti affetti da miopatie causate da deficit del Col6 sono state sottoposti a dieta controllata a basso contenuto di proteine ​​per 12 mesi e abbiamo valutato la presenza di autofagosomi e dei livelli di mRNA e proteine ​​per BECN1 / Beclin 1 e MAP1LC3B / LC3B nelle biopsie muscolari e nei leucociti del sangue. Sono state valutate la forza muscolare, la funzione motoria e respiratoria e i parametri metabolici. Dopo un anno di dieta a basso contenuto di proteine, i marcatori autofagici erano aumentati nei muscoli scheletrici e nei leucociti del sangue dei pazienti. La sicurezza del trattamento è dimostrata dalla conservazione della percentuale di grasso nella composizione corporea, forza muscolare e funzione. Inoltre, la ridotta incidenza di apoptosi delle fibre muscolari ha indicato benefici nell’omeostasi muscolare e i cambiamenti metabolici hanno indicato una migliore funzionalità mitocondriale. Questi dati forniscono la prova che la dieta con basso contenuto di proteine è in grado di attivare l’autofagia ed è sicura e tollerabile nei pazienti con Miopatie COL6, che indicano l’attivazione dell’autofagia come un potenziale bersaglio per applicazioni terapeutiche. Inoltre, i nostri risultati indicano che i leucociti nel sangue sono uno strumento promettente non invasivo per monitorare l’attivazione autofagica nei pazienti.

Introduzione: COL6 / collagene VI è una delle principali proteine ​​della matrice extracellulare dell’endomisio dei muscoli scheletrici. Le mutazioni dei geni COL6 (COL6A1, COL6A2 e COL6A3) causano miopatie correlate al COL6, un gruppo di malattie muscolari ereditarie rare che includono la miopatia di Bethlem (BM) e la distrofia muscolare congenita di Ullrich (UCMD), nonché la cintura degli arti e la miosclerosi varianti della miopatia. La BM è caratterizzata da debolezza muscolare assiale e prossimale, insieme a contratture delle articolazioni interfalangee delle ultime 4 dita. La BM è solitamente lieve e talvolta lentamente progressiva. L’insufficienza respiratoria fa parte dello spettro clinico e può verificarsi in pazienti ambulatoriali. L’UCMD è una grave distrofia muscolare congenita caratterizzata da esordio precoce, deperimento e debolezza muscolare generalizzata, contratture articolari prossimali e iperflessibilità articolare distale. Camminare autonomamente è raramente raggiunto o mantenuto nei bambini affetti da UCMD, che soffrono anche di insufficienza respiratoria precoce e progressiva. Non esiste attualmente una cura per BM o UCMD.

Abbiamo precedentemente dimostrato che la ciclosporina A è in grado di salvare alterazioni muscolari associate alla carenza di COL6 nei topi  malati e nelle cellule di pazienti BM o UCMD. Sebbene studi clinici abbiano indicato che la ciclosporina A può essere utile nel rallentare la progressione della malattia correggendo il mitocondrio disfunzione, la ben nota attività immunosoppressiva della ciclosporina A è un ostacolo importante e ostacola il suo uso a lungo termine soprattutto nei pazienti pediatrici. Studi recenti su topi malati e biopsie dei pazienti hanno fornito nuove informazioni sui meccanismi molecolari alla base delle miopatie correlate a COL6. Questi studi hanno dimostrato che un fallimento delle macchine autofagiche gioca un ruolo patogenetico importante nello spreco e nella debolezza muscolare. L’autofagia è un processo autodegradativo conservato in modo evolutivo che è essenziale per recuperare i nutrienti durante il digiuno e per la rimozione di componenti cellulari dannosi o danneggiati. Nei muscoli scheletrici di topi malati (col6a1), l’alterazione della formazione di autofagosoma innesca l’accumulo di mitocondri disfunzionali e di organelli nelle miofibre, portando all’apoptosi e alla miopatia. In particolare, il ripristino di un flusso autofagico appropriato da parte di genetica, farmacologica o approcci nutrizionali salva il fenotipo miopatico dei topi col6a1. In particolare, l’alimentazione di topi col6a1 per un mese con una dieta a basso contenuto di proteine ​​(LPD) porta ad un recupero dei difetti muscolari strutturali e funzionali.

Qui riportiamo i risultati di uno studio clinico pilota con un LPD condotto per 12 mesi in 7 soggetti adulti con mutazioni COL6 geneticamente caratterizzate (6 BM e 1 UCMD). Gli endpoint primari di questo approccio nutrizionale sono stati raggiunti con successo, poiché è stata dimostrata la sicurezza del trattamento e i muscoli dei pazienti hanno mostrato livelli aumentati dei marcatori autofagici BECN1 e MAP1LC3B / LC3B dopo il trattamento. Inoltre, e ancora più importante, questa risposta biologica è stata accompagnata dalla mancanza di progressione della malattia e dal miglioramento di alcuni parametri funzionali e metabolici. In particolare, l’incidenza dell’apoptosi nelle biopsie muscolari è stata significativamente ridotta dopo la dieta LPD. Questi risultati indicano che gli approcci nutrizionali possono essere efficacemente utilizzati per attivare l’autofagia in pazienti affetti da miopatie correlate a COL6 e puntare sull’attivazione dell’autofagia come un prezioso bersaglio terapeutico per migliorare la salute dei muscoli in questi pazienti. In termini più generali, i nostri dati forniscono un razionale per nuove opportunità di trattamento in un numero crescente di patologie muscolari e non muscolari associate a compromissione autofagica.

Risultati: Lo studio ha incluso 8 pazienti. Cinque donne e 3 uomini sono stati reclutati seguendo i criteri di iscrizione descritti di seguito. Un partecipante ha lasciato il processo subito dopo l’inizio della LPD a causa dell’intolleranza alimentare; questo paziente ha successivamente avuto un grave incidente stradale e non è stato in grado di partecipare a ulteriori valutazioni. I dati genetici e clinici dei pazienti sono riassunti nella Tabella 1. Il flusso dello studio è descritto nella Tabella S1.

Tabella 1. Descrizione, caratteristiche cliniche e caratterizzazione genetica dei 7 pazienti con miopatie correlate a COL6 che hanno partecipato allo studio LPD. I marcatori autofagici sono aumentati nei muscoli dei pazienti dopo un anno di LPD.

Lo stato dell’autofagia è stato valutato in biopsie muscolari monitorando la lipidazione LC3B. Abbiamo anche monitorato i livelli di proteina di BECN1, un componente chiave del meccanismo autofagico che è ridotto negli animali malati col6a1 e nei pazienti UCMD e BM. Quando abbiamo valutato i livelli di LC3B lipidato (LC3B-II), abbiamo trovato un effetto positivo della dieta sull’autofagia (Figura 1A e B). Infatti, la maggior parte dei pazienti ha mostrato un aumento dei livelli di LC3B-II dopo 12 mesi LPD (T12). È interessante notare che il paziente 5 ha mostrato una riduzione del contenuto proteico totale di LC3B (sia LC3B-I che -II) dopo il LPD (Figura 1A), sebbene il corrispondente trascritto sia stato indotto rispetto alla condizione di base (T0) (Figura 1C) , suggerendo la possibilità che in questa paziente la proteina LC3B fosse degradata dal flusso autofagico sostenuto. Inoltre, 4 pazienti su 7 hanno avuto un aumento dei livelli di proteina BECN1 dopo la dieta (Figura 1A e B). In particolare, i valori medi di questi marcatori autofagici erano significativamente aumentati nella coorte di pazienti dopo uno y di LPD (P = 0,018 per LC3B-II, P = 0,028 per BECN1). Anche l’espressione dei geni MAP1LC3B e BECN1 è aumentata rispetto alla visita di base, come dimostrato dall’aumento dei livelli di mRNA (Fig. 1C; P = 0,018 per MAP1LC3B, P = 0,028 per BECN1, per il confronto tra T0 e T12) . Inoltre, la microscopia elettronica delle biopsie muscolari da pazienti 1 e 3 a T12 ha rivelato la presenza di autofagosomi precoci contenenti mitocondri in diverse miofibre (Fig. 1D), e l’analisi quantitativa ha mostrato un aumento del numero di miofibre con autofagosomi e / o autolisosomi in tutti i pazienti a T12, rispetto a T0 (Fig. 1E; P = 0,016 dopo test Wilcoxon per dati accoppiati). L’analisi Western blot per PARK2 / parkin e le proteine ​​mitocondriali, come COX4I1 / COX IV e TOMM20, non ha mostrato alcuna differenza importante nelle biopsie muscolari dei pazienti tra T0 e T12 (Fig. S1). Inoltre, come riportato in precedenza per gli animali malati col6a1, la riattivazione di autofagia ha promosso la sopravvivenza delle fibre muscolari. In effetti, l’incidenza dei nuclei apoptotici, valutata dal dosaggio TUNEL nelle biopsie muscolari, è diminuita in 6 dei 7 pazienti dopo una y di LPD (Fig. 2A e B) e il valore medio dei nuclei apoptotici è diminuito significativamente a T12 (P = 0,016). Complessivamente, questi risultati indicano che un anno di dieta LPD ha attivato l’autofagia nelle biopsie muscolari di pazienti affetti da miopatie COL6.

Figura 1. Analisi dell’autofagia nelle biopsie muscolari di pazienti con BM e UCMD prima e dopo lo studio LPD. Figura 2. Test TUNEL su biopsie muscolari di pazienti con BM e UCMD prima e dopo lo studio LPD.

 

La composizione corporea e i parametri clinici rimangono stabili o leggermente migliorati dopo un anno di LPD: Come determinato dai registri alimentari, l’assunzione media di proteine ​​prima della LPD era di 1,3 g / kg / giorno (intervallo 0,8-2,1) e durante lo studio era 0,63 g / kg / giorno (intervallo 0,60-0,68). Indice di massa corporea (BMI) in T0 ha mostrato che un paziente era leggermente al di sotto del peso normale (paziente 4) e 2 pazienti erano in sovrappeso (pazienti 5 e 7). Tuttavia, la percentuale di massa grassa e l’indice di massa magra (ALM) a due raggi (DXA) a doppia energia ha mostrato che tutti i pazienti tranne uno (paziente 4) erano obesi e tutti tranne uno (paziente 7) erano anche sarcopenici (Tabella S2). Durante lo studio, i pazienti hanno perso il 9% di peso corporeo (4.17 ± 2.01 kg), il 7% di massa magra (2.26 ± 2.45 kg) e l’8% di massa grassa (1.91 ± 3.15 kg). Tuttavia, non c’era alcuna differenza statisticamente significativa nella percentuale di massa grassa e magra prima e dopo un anno di LPD (Tabella 2). Dopo il trattamento, l’ALM è sceso a meno di 0,6 kg in 3 pazienti e aumentato in 2 (0,2 e 1 kg); i 2 pazienti in sovrappeso hanno perso 3 e 4 kg (Tabella S2). I parametri biochimici del sangue non hanno mostrato alcun segno di malnutrizione proteico-calorica. In particolare, nonostante la diminuzione minima della massa magra, non vi è stato alcun significativo peggioramento di qualsiasi parametro di forza muscolare, inclusi l’impugnatura, la flessione del gomito, la flessione del ginocchio e l’estensione del ginocchio (tabelle 2 e S2). Ancora più importante, la funzione motoria è stata migliorata come dimostrato dai miglioramenti nei parametri funzionali. I valori medi della distanza percorsa in 6 min (6MWD) e del test a tempo 10 m (10 m) non hanno mostrato cambiamenti significativi e non hanno peggiorato come previsto, mentre il tempo di salire di 4 gradini (4 passaggi) è migliorato significativamente ( Tabella 2; Fig. 3A-C). L’effetto benefico del LPD è stato anche mostrato dai muscoli respiratori, con una migliore funzione respiratoria e un aumento della percentuale di capacità vitale forzata (FVC) molto vicino al significato (Tabella 2; Fig. 3D).

Figura 3. Parametri clinici dei pazienti prima e dopo lo studio LPD.

I parametri metabolici correlati ai mitocondri sono migliorati dopo un anno di LPD: Per valutare se l’attivazione della funzione mitocondriale e della respirazione influenzate dall’autofagia, abbiamo monitorato il metabolismo basale e i metaboliti correlati ai mitocondri nei pazienti prima e dopo la dieta. In particolare, il valore del quoziente respiratorio (RQ) è stato ridotto in tutti i pazienti a T12, con significatività statistica per il confronto con RQ a T0 (P = 0,031), indicando un’ossidazione lipidica potenziata (Figura 4A, Tabella S3). Poiché la β-ossidazione degli acidi grassi liberi è un processo mitocondriale, questo dato indica che la LPD ha indotto uno spostamento metabolico che è consistente con una maggiore attività ossidativa mitocondriale.

Tavolo 2. Valori medi dei parametri clinici per tutti i pazienti prima (T0) e dopo (T12) lo studio LPD.

In accordo con questo, tutti i pazienti mostravano una riduzione del lattato (compreso tra il 10% e il 60%) e una diminuzione dei livelli di acetato al T12, come rivelato dall’analisi della risonanza magnetica nucleare (Tabella 3; Fig. 4B). La ridotta concentrazione di lattato e acetato dopo LPD suggerisce un miglioramento della produzione di energia aerobica mitocondriale attraverso il ciclo dell’acido tricarbossilico, con una ridotta conversione di piruvato in lattato.

 

Figura 4. Parametri metabolici dei pazienti prima e dopo lo studio LPD. (A) Istogramma che mostra il quoziente respiratorio (RQ) calcolato a T0 e T12 per ciascun paziente (P1-P7). I valori RQ di ciascun paziente in T0 e T12 sono elencati nella Tabella S3. P = 0,031.
Tabella 3. Lattato: rapporto alanina in sieri di tutti i pazienti a T0, T6 e T12 e percentuali di riduzione del lattato (Δ%) dopo il LPD.

I leucociti del sangue rispecchiano l’autofagia muscolare: Per identificare i biomarcatori che rispecchiano l’autofagia nei muscoli, abbiamo valutato l’autofagia nei leucociti periferici isolati da campioni di sangue. Per prima cosa abbiamo usato il modello col6a1 del deficit di COL6 per valutare se la LPD innesca l’autofagia sia nei muscoli che nei leucociti. Topi sani e malati sono stati alimentati con dieta standard o LPD per 30 giorni, come precedentemente descritto, la lipidazione 15 e LC3B è stata valutata nel muscolo scheletrico e nei leucociti (Fig. 5; Fig. S2). Inoltre, il flusso autofagico è stato monitorato trattando gli animali con la colchicina per bloccare la fusione del lisosoma autofagosoma. La quantificazione delle macchie occidentali ha mostrato un’attivazione significativa dell’autofagia mediante LPD sia nei muscoli che nei leucociti (Figura 5A e B). È importante sottolineare che la lipidazione LC3B nei leucociti del sangue correlata con muscolo scheletrico, come rivelato dall’analisi di regressione lineare. I livelli di LC3B-II hanno mostrato una correlazione lineare significativa tra muscolo e leucociti sia per topi knockout di tipo selvatico che col6 (correlazione di Pearson, P = 6.084e-07 per topi wild-type; P = 0.003 per topi null col6a1) (Fig. 5C e D). Complessivamente, questi dati hanno rivelato che, nei roditori, i leucociti riflettono il flusso autofagico dei muscoli wild-type e COL6-deficienti e quindi possono essere utilizzati come biomarcatori.

 

Figura 5. L’attivazione dell’autofagia dopo LPD è simile nei muscoli e nei leucociti di topi wild-type e topi null col6a1. (A, B) Western blotting di MAP1LC3B / LC3B in lisati proteici di muscoli anteriori tibiali e leucociti del sangue (Leuko) da wild-type e col6a1.
Per tradurre questi risultati nell’uomo, abbiamo monitorato l’autofagia nei leucociti dei pazienti prima (T0), durante (T6) e dopo (T12) lo studio LPD. In accordo con i dati ottenuti nelle biopsie muscolari, i leucociti della maggior parte dei pazienti hanno mostrato un aumento della lipidazione LC3B e dei livelli BECN1 dopo LPD (Fig. 6A e B; Fig. S3A; P = 0.042 per LC3B-II, P = 0.062 per BECN1 , per il confronto tra T0 e T12 nella coorte di pazienti). È interessante notare che l’analisi Western blot ha mostrato un picco di lipidazione LC3B a T6 nei pazienti 6 e 7 e un rapido aumento della lipidazione LC3B a T6 nel paziente 4, suggerendo un adattamento tempo-dipendente alla dieta (figura S3B). Simile al muscolo, i leucociti del paziente 5 hanno mostrato lievi alterazioni della lipidazione LC3B. Al contrario, i leucociti del paziente 2 differivano dai muscoli e mostravano piccoli cambiamenti nella banda LC3B-II (Figura 6A e B). Analisi di correlazione per i dati Western blot ottenuti prima e dopo LPD hanno mostrato che i livelli BECN1 di biopsie muscolari e leucociti erano debolmente correlati a T0 (R = 0.467, P = 0.091) e significativamente correlati a T12 (R = 0.630, P = 0.033), considerando che non è stata trovata alcuna correlazione tra muscoli e leucociti per i livelli di proteina LC3B-II (visita basale: R = 0,085, P = 0,527, visita T12: R = 0,139, P = 0,410). È importante sottolineare che i valori medi di questi marcatori nei leucociti a T0 e T12 hanno mostrato che la lipidizzazione di LC3B era significativamente aumentata dopo una y di LPD (P = 0.042), mentre i livelli di BECN1 mostravano una tendenza verso l’aumento, vicino alla significatività statistica (P = 0.062). Complessivamente, questi risultati indicano che, analogamente alle biopsie muscolari, l’attivazione dell’autofagia si è verificata nei leucociti dei pazienti dopo 1 anno di LPD.
Figura 6. Analisi dell’autofagia nei leucociti del sangue dei pazienti con BM e UCMD prima e dopo lo studio LPD. (A) Western blot dei livelli di MAP1LC3B / LC3B e BECN1 nei lisati proteici dei leucociti del sangue a T0, T6 e T12. Per il paziente 1, il campione di sangue al T6 non era disponibile.
Discussione: I risultati di questo trial pilota nutrizionale, sebbene condotto su una piccola quantità di pazienti affetti da una malattia rara, forniscono preziose informazioni per la comunità medica. Infatti, questo è il primo studio clinico che mostra l’attivazione autofagica in un disturbo ereditario umano, con effetti benefici nel contrastare la progressione della malattia. Il miglioramento di più parametri funzionali, nonostante un certo grado di perdita di peso corporeo, è un risultato notevole, a conferma della sicurezza e dei potenziali benefici dell’attivazione dell’autofagia nelle miopatie correlate a COL6. I nostri dati suggeriscono che la LPD nelle miopatie umane COL6 riporta gli effetti benefici osservati nei topi malati col6a1. Simile al modello animale, questo approccio nutrizionale era in grado di indurre l’autofagia, un percorso che svolge un ruolo fondamentale nella rimozione degli organelli danneggiati e dei mitocondri disfunzionali , che porta a migliorare la mia salute delle fibre muscolari.

Dato l’inizio precoce e il decorso progressivo delle miopatie correlate al COL6, i pazienti generalmente peggiorano con il tempo, ma non in modo prevedibile. Si prevede che il trattamento con LPD aumenti la rottura delle proteine ​​e degli organelli mediata dall’autofagia e, di conseguenza, i pazienti perdano 7 % della massa muscolare. Tuttavia, i nostri dati indicano che nonostante un certo grado di perdita di massa muscolare e il fatto che i pazienti sono invecchiati, la forza assoluta dei muscoli delle gambe non diminuiva dopo un anno di LPD, e l’attivazione dell’autofagia ha comportato una diminuzione dell’apoptosi della miofiber, una migliore funzione motoria e respirazione migliorata. Queste scoperte apparentemente paradossali sono prontamente spiegate dal controllo critico che l’autofagia suscita sulla qualità delle proteine ​​e degli organelli. Promuovendo il flusso autofagico, gli organelli e le proteine ​​danneggiati vengono eliminati ei muscoli perdono parte della loro massa ma diventano migliori in funzione. Al contrario, l’inibizione dell’autofagia nei muscoli è sufficiente per indurre uno spreco e una debolezza. Coerentemente con i nostri dati, un recente lavoro ha dimostrato che la restrizione calorica a lungo termine in volontari sani umani aumentando i livelli di BECN1 e LC3B favorisce cambiamenti benefici nei muscoli scheletrici, come come infiammazione ridotta e migliore proteostasi.

Si può affermare che lo spostamento metabolico verso l’ossidazione lipidica che abbiamo rilevato in tutti i pazienti dopo un anno di LPD si basa sulla migliorata funzione mitocondriale suscitata dall’attivazione dell’autofagia. Ciò è coerente con il fatto che l’β-ossidazione degli acidi grassi è uno dei principali percorsi del metabolismo energetico che operano all’interno dei mitocondri. L’osservazione che il lattato e l’acetato sierico diminuivano dopo un anno di LPD, ulteriori punti a una più efficiente attività ossidativa mitocondriale. Sottolineiamo che i nostri dati rappresentano un’analisi “statica” dell’autofagia e non possono fornire approfondimenti sul flusso autofagico, a causa della mancanza di metodi appropriati per il rilevamento del flusso nell’uomo. Ciò implica che l’attivazione dell’autofagia potrebbe essere presente anche in quei pazienti che mostrano piccoli o nessuna modifica nei livelli di lipidazione LC3B e / o BECN1.

I limiti di questo studio clinico pilota sono inevitabilmente legati alla bassa prevalenza di BM e UCMD e al piccolo numero di pazienti eleggibili per tale sperimentazione pilota. In effetti, è estremamente difficile progettare studi randomizzati per pazienti affetti da miopatie correlate a COL6 o includere un gruppo di controllo dietetico standard per la LPD, a causa di ovvi vincoli etici sollevati dalle biopsie muscolari multiple invasive richieste per valutare l’efficacia. Nonostante queste limitazioni intrinseche, le nostre scoperte sono molto promettenti e aprono la strada ad interventi nutrizionali finalizzati all’attivazione dell’autofagia nelle patologie neuromuscolari. In realtà, l’obiettivo di questo studio era quello di studiare l’utilità di indirizzare l’autofagia nelle miopatie correlate a COL6, fornendo così le basi e giustificando futuri studi clinici più ampi. Va sottolineato che questo studio clinico pilota non ha lo scopo di raccomandare la LPD come trattamento definitivo a lungo termine per i pazienti con BM o UCMD. Invece, il nostro studio è stato finalizzato a valutare se l’autofagia può essere attivata nei pazienti BM e UCMD e se tale attivazione è sicura e ha effetti benefici verso una terapia futura. Inoltre, utilizzando l’intervento nutrizionale come approccio semplice e sicuro per attivare l’autofagia e monitorando i segni vitali dei pazienti, siamo stati in grado in questa fase iniziale di escludere dall’analisi ulteriori effetti collaterali che potrebbero essere stati attribuiti a un farmaco o a un’autofagia chimica activator.

C’è una crescente necessità di identificare biomarcatori e strumenti per monitorare l’autofagia negli esseri umani senza utilizzare biopsie. Il nostro lavoro è il primo studio che dimostra che i leucociti del sangue rappresentano un promettente strumento non invasivo per valutare lo stato dell’autofagia nelle malattie neuromuscolari, sia negli animali che in gli esseri umani. Questa scoperta è particolarmente rilevante per i tessuti non facilmente accessibili alla biopsia, come il cervello e il cuore, e in cui l’autofagia è un importante giocatore omeostatico. Infatti, l’autofagia è un obiettivo prezioso e druggable per combattere i disturbi neurodegenerativi, come le malattie di Huntington, Alzheimer e Parkinson, così come cardiomiopatie congenite o acquisite. Infine, i nostri dati supportano anche la possibilità di studiare lo stato autophagy negli esseri umani mediante la raccolta e l’uso di leucociti del sangue per le misurazioni biochimiche. Complessivamente, i nostri dati hanno soddisfatto gli obiettivi di questo trial clinico LPD pilota, dimostrando non solo che l’autofagia può essere attivata nei pazienti miopatici, ma anche che l’autofagia è un obiettivo prezioso per nuovi approcci terapeutici. Nel prossimo futuro, la combinazione di composti naturali che modulano l’autofagia con programmi nutrizionali appositamente progettati può consentire di sinergizzare le loro azioni e migliorare ulteriormente i lievi benefici ottenuti in questo studio dalla LPD. In conclusione, i risultati che abbiamo ottenuto con un trattamento LPD in un anno nei pazienti con BM e UCMD aprono il campo per ulteriori studi su altre miopatie ereditarie e distrofie muscolari in cui l’alterazione dell’autofagia è parte dei meccanismi patogenetici che causano deperimento muscolare e debolezza.

Pazienti e metodi: Progettazione dello studio e obiettivi: Questo è stato uno studio pilota di 12 mesi sull’efficacia, la sicurezza e la tollerabilità della LPD in pazienti adulti con diagnosi di BM o UCMD. I pazienti sono stati reclutati tra novembre 2011 e febbraio 2012 e un LPD di un anno è stato effettuato da marzo 2012 a giugno 2013. Il progetto di studio è stato supervisionato scientificamente da Luciano Merlini, MD, e lo studio clinico è stato localizzato presso l’Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna, Italia. Lo studio è stato eseguito in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal Comitato di etica medica dell’Istituto ortopedico Rizzoli. Questo studio è stato registrato con ClinicalTrials.gov, numero NCT01438788. L’endpoint primario dello studio era l’attivazione dell’autofagia misurata come variazione nei marcatori biologici dell’autofagia nella biopsia muscolare dal basale al giorno 365. Le misure di outcome secondario includevano sicurezza e cambiamenti nei parametri nutrizionali, massa muscolare, forza muscolare e funzione. Un flusso di studio dettagliato è mostrato nella Tabella S1.

Criteri di iscrizione: I pazienti di età pari o superiore a 18 anni, con diagnosi clinica e molecolare di UCMD o BM e senza gravi complicanze della medicina interna erano ammissibili. Il reclutamento del paziente era subordinato al rispetto dei seguenti criteri: le donne in età fertile devono avere un test di gravidanza negativo e devono utilizzare un adeguato metodo contraccettivo durante lo studio; nessun trattamento precedente con ciclosporina A entro 6 mesi prima dell’inizio dello studio; disponibilità e capacità di aderire al programma delle visite di studio e ad altri requisiti del protocollo; capacità di fornire il consenso informato scritto. Le donne in gravidanza o in allattamento e i pazienti con patologie epatiche o renali in atto o pregressi o con patologie gravi che interferiscono con lo studio non erano eleggibili. Valutazione del paziente: La valutazione della sicurezza del sangue e delle urine, lo stato generale e nutrizionale e l’aderenza alla dieta sono stati valutati ogni mese dalla visita di riferimento (vedere Materiale supplementare per ulteriori dettagli). Le biopsie del muscolo tibiale anteriore sono state ottenute all’inizio (T0) e alla fine (T12) dello studio. Inoltre, il BMI, le circonferenze (vita, fianchi) e la composizione corporea mediante DXA, sono stati valutati anche al basale (visita T0), 6 mesi (visita T6) e 12 mesi (visita T12). La forza muscolare e la funzione motoria sono state valutate a T0 e T12; i leucociti sono stati raccolti a T0, T6 e T12.

Stato nutrizionale e dieta: La composizione corporea determinata da DXA (Hologic 4500 W, versione software 11.2, Hologic Inc., Waltham, MA) includeva la stima della massa corporea, ALM, massa grassa e contenuto minerale osseo (Tabella S2). L’obesità sarcopenica è stata definita come ALM diviso per statura al quadrato <7,26 kg / m2 negli uomini e 5,45 kg / m2 nelle donne e come percentuale di grasso corporeo superiore al 28% negli uomini e al 40% nelle donne. Misure antropometriche incluse peso corporeo, altezza , BMI e circonferenze (vita, fianchi). Il dispendio energetico a riposo e la RQ sono stati valutati nello stato post-assorbimento mediante calorimetria indiretta (CareFusion Vmax Encore, San Diego, CA). L’assunzione di energia e macronutrienti è stata valutata con un record alimentare 7-d. Il software Metadieta (Meteda S.r.l., San Benedetto del Tronto, Italia) è stato utilizzato per calcolare i contenuti energetici, proteici, carboidrati e lipidici della dieta. Le preferenze alimentari o le intolleranze sono state valutate tramite un’intervista dietista. Lo stile di vita è stato valutato durante l’intervista. L’intervento nutrizionale consisteva in un LPD personalizzato con una quantità di calorie che corrispondeva al dispendio energetico. Il fabbisogno energetico è stato calcolato come il prodotto del dispendio energetico a riposo (kcal / giorno) e del livello di attività fisica. Il contenuto proteico giornaliero del LPD era fino a 0,68 g di proteine ​​/ kg di peso corporeo. Le quantità di carboidrati e lipidi nella dieta sono state calcolate come percentuale del fabbisogno energetico giornaliero totale dopo il ritiro delle calorie derivate dalle proteine ​​(Tabella S4). Nel caso di pazienti in sovrappeso (25,0 <BMI <29,9), la quantità di proteine ​​è stata calcolata sulla base dell’altezza e di un peso corporeo ideale corrispondente a un BMI di 22,5 kg / m2. La ridotta quantità di proteine ​​nella dieta è stata ottenuta attraverso prodotti a basso contenuto di proteine ​​come pasta, pane o biscotti (Aproten, Latina, Italia) forniti mensilmente ai pazienti. Sono stati raccolti pacchetti vuoti per determinare la conformità. Le proteine ​​animali di alta qualità sono state mantenute nella dieta. Il menu settimanale è stato pianificato tenendo conto delle preferenze alimentari del paziente. Un dietologo era disponibile tramite contatto telefonico quotidiano oltre alle riunioni mensili per garantire il rispetto a lungo termine della dieta.

Valutazione della sicurezza: Al basale e poi ogni mese, tutti i pazienti sono stati sottoposti ad un esame fisico completo con misurazioni dei segni vitali. Plasma e urina sono stati ottenuti per determinare la funzionalità epatica e renale, i livelli di elettroliti e il numero di cellule (vedere Materiale supplementare). Sono stati registrati l’uso di farmaci concomitanti e il numero di eventi avversi.

Forza muscolare e funzione: La forza isometrica massima è stata valutata utilizzando un dinamometro portatile (Tipo CT 3001, Citec, CIT Technics BV, Groningen, Paesi Bassi). Quattro movimenti muscolari sono stati esaminati bilateralmente: impugnatura, flessione del gomito, flessione del ginocchio e estensione del ginocchio. La forza massima di 3 tentativi è stata utilizzata per l’analisi dei dati. La FVC è stata determinata con uno spirometro elettronico, e i valori predetti per il percento sono stati calcolati in base ai valori normali pubblicati.7 Il test del cammino a 10 minuti (10 m), il test su 4 scale (4 passaggi) e la distanza percorsa in 6 sono stati anche valutati min (6MWD).

Biopsia muscolare e microscopia elettronica: Parte della biopsia è stata congelata in azoto liquido e utilizzata per il western blot e TUNEL, mentre la porzione rimanente è stata fissata con glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato 0,1 M e processata per microscopia elettronica come descritto in precedenza. Per l’analisi quantitativa di miofibre con autofagosomi o autolisosomi, abbiamo analizzato almeno 200 fibre muscolari ottenute da 5 diversi livelli per ogni biopsia.

Raccolta di campioni di sangue: Campioni di sangue al basale, visita T6, e visita T12 sono stati sempre raccolti alla stessa ora del mattino, in pazienti affamati (condizione pre-prandiale). A T0 e T12, subito dopo la raccolta del sangue, ogni paziente è stato sottoposto a biopsia muscolare per essere analizzato in correlazione con un campione di sangue. Estrazione dell’RNA e RT-PCR quantitativa: Sezioni (spessore di 20 μm) sono state tagliate da biopsie muscolari e l’estrazione di RNA è stata eseguita utilizzando il reagente TRIzol (Life Technologies, 15596-018) in base alle istruzioni del produttore. L’RNA totale (500 ng) è stato retrotrascritto con il kit SuperScript III (Life Technologies, 18080-051) seguendo le istruzioni del produttore. La PCR quantitativa è stata eseguita su uno strumento RotorGeneQ (Qiagen), utilizzando primer specifici e un master mix contenente CyBr green (Qiagen, 204076). Le sequenze di primer sono fornite nella Tabella S4. Le analisi dell’RNA sono state eseguite come test a singolo cieco.

Dosaggio TUNEL in situ: Il dosaggio TUNEL è stato eseguito con il kit di rilevamento della morte cellulare in situ, TMR red (Roche, 12156792910), su sezioni muscolari di 7 μm di spessore preparate da biopsie crioconservate. Dopo 20 minuti di fissazione (paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4, Santa Cruz Biotechnology, sc-281692), i vetrini sono stati lavati in soluzione salina tamponata con fosfato e permeabilizzati per 2 minuti in Triton X-100 allo 0,1% (Sigma, T9284), citrato di sodio allo 0,1%. La reazione enzimatica è stata eseguita secondo le linee guida del produttore. La controcolorazione nucleare è stata ottenuta utilizzando Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, B1155). Il numero di nuclei TUNEL-positivi è stato calcolato in almeno 25 campi selezionati casualmente per biopsia utilizzando un microscopio Zeiss Axioplan equipaggiato con una fotocamera digitale, e quindi è stato confrontato con l’area campionata relativa. I valori medi sono rappresentativi di 2 repliche tecniche di esperimenti TUNEL per ogni condizione. Misurazione NMR: I campioni di siero sono stati raccolti da pazienti a T0, T6 e T12 e preparati direttamente in provette NMR da 5 mm. I campioni congelati sono stati scongelati a temperatura ambiente e 400 μl sono stati integrati con 100 μl di D2O. Spettri NMR sono stati acquisiti a 400,13 MHz su uno spettrometro (Avance400, Bruker) a 298 K. Per ogni campione 1H NMR monodimensionale è stato acquisito utilizzando una sequenza di spin-echo Carr-Purcell-Meiboom-Gill soppressa dall’acqua (Software Bruker, MA, USA). Gli spettri sono stati riferiti al doppietto di alanina a 1,49 ppm. Animali: Topi C57BL / 6N sono stati ottenuti da Charles River. I (col6a1 – / -) topi sono stati generati nel nostro laboratorio come descritto in precedenza. Tutti i topi sono stati alloggiati in un ambiente controllato con 12 ore di luce / 12 ore di ciclo buio e una temperatura di 23 ° C. I topi sono stati forniti con chow standard e acqua ad libitum e sono stati effettuati esperimenti alle 9 del mattino su topi accoppiati per sesso ed età con accesso libero all’acqua, come descritto in precedenza. Per il LPD, i topi sono stati alimentati ad libitum per 1 mo con Chow standard (Laboratorio Dottori Piccioni, # 52) o 5% Chow purificato con proteine ​​(TestDiet, T-5767-7155) con accesso libero all’acqua, come descritto in precedenza.15 Durante gli ultimi 2 giorni di dieta standard o LPD, topi hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali quotidiane con 0,4 mg / kg / die di colchicina (Sigma-Aldrich, C9754), un inibitore della fusione autofagosoma-lisosoma, permettendo l’analisi del flusso autofagico. Tutti gli animali sono stati sacrificati dalla dislocazione cervicale, il sangue era raccolti dalla puntura cardiaca e i tessuti di interesse sono stati sezionati e fissati. Le cellule del sangue mononucleate periferiche sono state separate mediante centrifugazione in densità (Ficoll-Paque PREMIUM 1.084, 17-5446-02, GE Healthcare) e lisate in tampone RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1% Nonidet P-40 [Sigma, I8896 ], 150 mM di NaCl, 10% di glicerolo, 10 mM di EDTA, 20 mM di fluoruro di sodio, 5 mM di sodio pirofosfato, 1 mM di Na3VO4, 1 mM di fenilmetilsolfonil fluoruro), integrati con fosfatasi e inibitori della proteasi (Sigma, P5726). Sono stati analizzati almeno 3 animali per condizione sperimentale. Macchia occidentale: Le biopsie muscolari congelate sono state polverizzate e lisate come precedentemente descritto. Leucociti del sangue periferico umano sono stati separati mediante centrifugazione in densità (LMS 1077, Laboratori PAA) e lisati in tampone RIPA contenente inibitori della proteasi. Per ciascun campione, una uguale quantità di lisato (30 μg per lisati muscolari umani, 50 μg per lisati muscolari di topo, 20 μg per leucociti umani e di topo) è stata ridotta dall’esposizione al 20% di β-mercaptoetanolo e sottoposti a SDS-PAGE come precedentemente descritto. Le proteine ​​sono state trasferite durante la notte su una membrana di trasferimento PVDF (Thermo Scientific, 88518) a 4 ° C. Dopo il blocco con soluzione di latte secco al 5%, le membrane sono state sondate con i seguenti anticorpi primari: anti-BECN1 (1: 1000; Cell Signing Technology, 3738), anti-LC3B (1: 800; Novus, NB-100 2220; : 1000; Sigma-Aldrich, L7543); anti-ACTB / β-ACTIN (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, sc-1616); anti-GAPDH (1: 50.000; Millipore, MAB374); proteina anti-RPS6 / ribosomiale S6 (1: 1000; Cell Signaling Technology, 2217); anti-PARK2 (1: 500; Santa Cruz Biotechnology, sc-32282); anti-COX4I1 (1: 2000; Cell Signaling Technology, 4844); anti-TOMM20 (1: 250; Santa Cruz Biotechnology, sc-11415). Le analisi biochimiche su campioni di muscoli umani sono state eseguite come test a singolo cieco. Sono stati utilizzati controlli di caricamento adeguati per ciascun tessuto (GAPDH per lisati di proteine ​​muscolari, RPS6 per lisati di leucociti di topo). La colorazione con Ponceau rosso del contenuto proteico totale è stata anche eseguita per tutti gli esperimenti di western blotting (non mostrati).

Approvazione dello studio: A tutti i partecipanti è stato fornito un consenso informato scritto e l’approvazione è stata ottenuta dal Comitato etico dell’Istituto ortopedico Rizzoli (ClinicalTrials.gov, numero NCT01438788). Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo tutte le leggi italiane pertinenti e sono stati approvati dal Comitato Etico dell’Università di Padova. Statistica: Abbiamo utilizzato un test Wilcoxon non parametrico a due code con segno firmato per campioni accoppiati per determinare se vi fosse una differenza significativa in tutte le variabili da T0 a T12. L’analisi di correlazione di Pearson è stata utilizzata per determinare la relazione tra induzione dell’autofagia nei muscoli e nei leucociti del sangue e sono indicati il ​​coefficiente di correlazione (R) e il valore di P. Valori P <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. I valori medi ottenuti da repliche tecniche (western blotting, qRT-PCR, TUNEL) sulla stessa biopsia sono mostrati senza errore standard della media, poiché appartengono allo stesso campione biologico. Tutti i valori aggregati sono riportati come media ± errore standard della media, se non diversamente indicato.

FONTE, vai all’articolo in inglese: Pubmed

 

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